體內成像，也就是活體成像技術發(fā)展至今，已經可以稱為活體熒光成像了，采用熒光成像具有操作簡單，結果直觀，靈敏度高等優(yōu)點，但雖然如此，活體熒光成像依然存在許多問題，首先就是信號水平不高，假陰性較多的問題，2008年，也就是細胞成像技術被《Nature Methods》評為年度技術的那一年，熒光顯微技術煥發(fā)出了全新的光彩，超高分辨率熒光顯微技術誕生了。

 

傳統(tǒng)光學顯微鏡受限于光的波長，對于200nm以下的小東西只能搖頭興嘆。雖然電子顯微鏡可以達到納米級的分辨率，但通電的結果容易造成樣品的破壞，因此能觀測的樣本也相當有限。分子生物學家雖然可以做到把若干想觀察的蛋白質貼上熒光卷標，但這些蛋白質還是經常擠在一塊，在顯微鏡下分不出誰是誰。

 

之后幾年高分辨率熒光顯微鏡跨越了一大步，使得研究者可以從納米級觀測細胞突起的伸展，從而宣告200—750納米大小范圍的模糊團塊的時代結束了。比如利用光敏定位顯微鏡：PALM可以用來觀察納米級生物，相較于電子顯微鏡有更清晰的對比度，如果給不同蛋白接上不同的熒光標記，就能用來進一步研究蛋白質間的相互作用。

 

2006年華裔科學家莊小威研究組開發(fā)了一種隨機光學重建顯微鏡（stochastic optical reconstruction microscopy, STORM）的技術。使用STORM可以以20nm的分辨率看到DNA分子和DNA-蛋白質復合體分子。這一方法基于光子可控開關的熒光探針和質心定位原理，在雙激光激發(fā)下熒光探針隨機發(fā)光，通過分子定位和分子位置重疊重構形成超高分辨率的圖像，其空間分辨率目前可達20nm。STORM雖然可以提供更高的空間分辨率，但成像時間往往需要幾分鐘，同時還不能滿足活體實時可視的成像的需要，發(fā)展空間很大。

 

與此同時，另外兩個研究組也報告了新方法提高了分辨率，他們的技術稱為熒光激活定位顯微鏡技術，簡稱FPALM。2007年，研究人員證實FPALM可以用來檢測脂質筏中聚集的蛋白。

 

自此之后，熒光顯微技術飛速發(fā)展，研究人員首先將PALM和單粒子失蹤結合起來探測肝細胞膜蛋白的運動，之后莊小威研究組又展示了3D STORM成像，證明這比三維空間衍射極限空間分辨率更好。

 

除此之外來自哈佛大學的謝曉亮教授將SRS顯微技術與核磁共振成像（MRI）技術聯(lián)合起來，從而能快速靈敏的捕捉活體組織中分子運動，比如血細胞擠壓通過血管的過程。

 

這項技術鏡頭分辨程度達到亞細胞水平，可記錄下蛋白、脂肪及細胞內液的情況。由于SRS顯微鏡可以探測到原子間化學鍵的共振，因此無需熒光標記。研究人員認為SRS顯微鏡可以在腫瘤摘除手術方面有所幫助，加快手術進程。傳統(tǒng)的樣本分析需要花費約20分鐘，SRS 顯微鏡幾乎可以做到實時掃描。

 

2010年雙光子顯微鏡的出現(xiàn)讓大腦成像系統(tǒng)有了進一步的發(fā)展，雙光子顯微鏡可探測至大腦內部1毫米的深度，這超過普通光學顯微鏡的十倍。而利用熒光傳感器探測神經元活動則使數(shù)據更加穩(wěn)定可靠。這些新技術與制備工藝的完美結合為人類研究大鼠和小鼠的大腦提供了物理的和光學的方法，從而使活體動物完整大腦組織的神經信號傳遞的可視性得以實現(xiàn)。

 

另外在腫瘤組織成像方面，來自美國的科學家們利用一種稱為非線性干涉成像技術（NIVI）的新型顯微檢測技術對大鼠乳腺癌細胞和組織進行掃描在不到五分鐘的時間內生成了易讀的彩色編碼組織圖像，圖像中腫瘤邊界清晰，準確率高達99%。

 

今年，來自加州大學舊金山分校研究人員又報道了一種活體肺組織實時成像技術——高速雙光子成像（video-rate,two-photon imaging），這種技術能首次在不影響肺組織正常生理功能的情況下，實現(xiàn)對細胞活動進行實時成像觀測。而來自美國能源部布魯克海文國家實驗室的研究人員開發(fā)了一種新型的RatCAP PET活體動物成像系統(tǒng)，這一新型設備為神經科學家們研究處于清醒和活動狀態(tài)下的動物大腦功能和行為提供了新工具。

 

除此之外，值得重點關注的還有單層光顯微技術（light sheet microscopy），這一顯微技術利用薄的，扁平的單層光照射生物樣品，從而可以對數(shù)毫米的樣品進行觀察，并能進行熒光成像。

 

利用這種技術，研究人員可以觀察細小生物體和胚胎組織。他們還將雙光子激活與單層光顯微技術結合在了一起，從而獲得了能進行高分辨率，高穿透深度（可以觀察到三維樣品內部），以及高成像速度的活體生物成像的新技術。