摘要：為了快速、定量檢測肉類食品中瘦肉精含量，采用了一種先進的激光誘導熒光技術進行檢測。首先將稀釋好的樣品滴加在用免疫層析技術制作的試紙卡上，然后使用638 nm波長的半導體激光器照射試紙卡，激發(fā)出的熒光通過光敏二極管接收，通過采集熒光強度來實現瘦肉精含量的檢測。通過實驗驗證，該檢測系統(tǒng)能夠快速、定量、精確的檢測瘦肉精的含量，檢測時間為6 s，測量量程為0.0～0.3 ppb，檢測靈敏度為0.01 ppb。

關鍵詞：瘦肉精;激光誘導熒光技術;免疫層析技術;半導體激光器;光敏二極管

引言

本設計在傳統(tǒng)的免疫法基礎上進行改良，采用了激光誘導熒光技術和熒光免疫分析法，實現了對瘦肉精的快速、定量、精確檢測，具有高分辨率、快速響應、高靈敏度、抗干擾能力強等優(yōu)點。

1 檢測系統(tǒng)的工作原理與組成

1.1 光學檢測原理

本設計選用的半導體激光器的光功率最大是5 mW，最大工作電流是40 mA，正常工作電流35 mA，正常工作電壓是2.2 V，最大反向工作電壓是2 V，波長范圍是630～640 nm，中心波長為638 nm。激發(fā)出來的熒光波長為680 nm，所選用的光敏二極管S5106能夠感應的波長范圍是320～1 100 nm，接收靈敏度最高的是960 nm的光，接收熒光的靈敏度約為0.45。

半導體激光器打出的638 nm波長的激光通過二向色鏡反射，反射的激光再通過透鏡1聚焦到檢測試紙卡上，這樣激光能量能夠最大化地聚集到試紙卡上，此時能最大激發(fā)出熒光;激發(fā)出來的680 nm的熒光通過二向色鏡透射，熒光照射到濾光片上，濾光片透過的光波長為660～700 nm，這樣不在這個波長范圍的雜散光就能被濾除掉;熒光再通過透鏡2聚焦到光闌上面的光孔，光闌也能擋住一部分雜散光，聚焦的熒光能夠最大化地聚集到光敏二極管的接收面上，這樣設計的光路不僅能夠很好地濾除雜散光，而且還能最大化地聚集激光能量和最大化地激發(fā)熒光，激發(fā)的熒光也能夠最大化地聚集到光敏二極管上，這樣能最有效地抑制噪聲、最有效地激發(fā)熒光和接收熒光，有利于熒光信號的采集和測量的精度提高。

光路檢測圖如圖1所示。

1.2 試紙卡制作原理

免疫層析技術是建立在層析技術和抗原-抗體特異性免疫反應基礎上的一項新興免疫檢測技術。免疫層析技術以固定有檢測線T和控制線C的條狀纖維層析材料為固定相，測試液為流動相，通過毛細作用使待測物在層析條上移動。其巾待測物在T線處發(fā)生特異性免疫反應，游離物在C線處發(fā)生免疫反應。

常用免疫層析熒光法包括競爭法和夾心法，本設計檢測法采用競爭法，競爭法主要用于測量小分子抗原，如克倫特羅、萊克多巴胺等。競爭法試紙卡制作示意圖如圖2所示。

待測樣本中的抗原濃度越高，則熒光素標記的抗原與單克隆抗體形成抗原抗體復合物的量就越少，T線上熒光免疫復合物的量也就越少，待測樣本中克倫特羅的濃度與T線信號成負相關。而C線上捕獲的熒光素標記兔抗信號值則相對固定。通過激光對檢測卡進行掃描，根據克倫特羅濃度與熒光信號強度成負相關，獲得待測樣本中克倫特羅的準確濃度。

1.3 系統(tǒng)硬件設計

系統(tǒng)硬件主要由控制器、電源、激光器驅動與保護、步進電機驅動、信號處理及采集、按鍵與顯示屏等組成?？刂破鞑捎没贏RM Cort ex—M4核的STM32F407VGT6，主頻頻率為168 MHz。主要硬件框圖如圖3所示。半導體激光器的驅動采用恒流驅動，驅動電流值由控制器設定，激光誘導的熒光束通過光敏二極管接收后轉換成電流值，電流值轉換成電壓后經過放大和濾波送到A/D芯片采集，采集后轉換成濃度值在顯示屏上顯示，實現定量檢測。試紙卡通過步進電機驅動做直線運動，實現整個試紙卡的掃描采樣。下面主要介紹半導體激光器的驅動電路和前置信號處理電路。

1.3.1 半導體激光器的驅動電路

半導體激光器的驅動電路主要由電流源組成。激光器對電流沖擊的承受能力較差，電流微小的變化將引起光輸出的變化，這些變化有可能影響激光器的使用壽命，因此在實際應用中對驅動電流源的性能和安全保護有很高的要求。為了能夠很好地觀察熒光信號的強弱變化，設計激光器的電流源連續(xù)可調節(jié)，改變驅動電流大小，同時改變激光器的光功率。該電路的原理圖如圖4所示，電流源供電通過LDO給其供電，減小電源噪聲，使激光器工作在穩(wěn)定可靠條件下。

U1為數字轉化為模擬信號芯片，輸出電壓在0～4.096 V可調，電流源由運算放大器U2A，精密電阻R1、R2、R4、R7和i極管Q1組成。原理如下，根據虛斷的概念可得：

由式(7)可以得知，半導體激光器的驅動電流與激光器的阻抗無關，只與輸入電壓VIN和精密電阻R5、R6相關，驅動電流通過調節(jié)輸入電壓大小實現連續(xù)可調。

1.3.2 信號處理電路

光敏二極管的PN結有一個結電容和一個寄生電阻，結電容和采樣電阻組成了一個RC充電回路，RC值的大小決定了光敏二極管的響應速度。光敏二極管在反向偏置電壓作用下工作，再加上寄生電阻的存在，在沒有光信號輸入時，光敏二極管仍然會流出電流，該電流稱為暗電

流。S5106的暗電流正常值為0.2 nA。由于結電容的存在，該結電容延遲了信號的響應，在輸出信號端會產生震蕩，在取樣電阻R2上需并聯(lián)一個合適容值的電容C4用來對電路進行補償，消除信號的震蕩。

當激光照射在試紙卡上時，激發(fā)出來的熒光反射到S5106上形成光電流，通過電阻R2實現I/V轉換，將電流轉換成電壓值。由于熒光信號非常微弱，產生的光電流值一般都為幾個nA，再加上運算放大器輸入級偏置電流的存在，為減小偏置電流對光電流的影響，一般需要選取偏置電流極小的運算放大器，可選取pA級別的。其中I/V轉換原理圖如圖5所示。

1.4 系統(tǒng)軟件設計

1.4.1 系統(tǒng)軟件總流程

系統(tǒng)軟件設計采用C語言開發(fā)，主程序結構如圖6所示。儀器上電后，進行系統(tǒng)初始化，讀取外部EEPROM的保存參數，接著系統(tǒng)開始自檢，液晶屏顯示“系統(tǒng)自檢中”。自檢內容包括電源自檢、外部RTC自檢、外部EEPROM自檢、電機自檢、激光器自檢、電路自檢、溫度傳感器自檢。自檢不通過，則報警，液晶屏顯示相應的報警碼，否則進入主菜單界面。在主菜單頁面中，在“測試”頁面中按下ENTER鍵進入測試流程，在“查詢”頁面中按下ENTER鍵進入歷史記錄流程，在“設置”頁面中按下ENTER鍵則進入設置流程。在設置頁面中，在“時間與日期”頁面中按下ENTER鍵進入設置時間與日期流程。在“清空歷史記錄”頁面中按下ENTER鍵進入清空歷史記錄流程。在“信息”頁面中按下ENTER鍵查看儀器的基本信息。

1.4.2 尋峰算法

(1)尋峰要求

①任意尋峰范圍：通過測試試紙條得知，共300個點，從START到END，如200～500。

②若為選取的峰，則峰高必須大于一個閾值THRESHOLD，如100 mV。

③尋峰完畢后，峰的個數必須為2個，否則尋峰失敗。

④峰的寬度通過測試試紙得知，是一個定值WIDTH，如60。

⑤通過計算峰高之比來求得比值。

⑥可往本底不平滑的情況進行。

(2)自動尋峰算法

自動尋峰方法有多種，如高斯乘積函數法，導數法(一階、二階、三階)，對稱零面積法，協(xié)方差法等。其中，高斯乘積函數尋峰法可靠性較差;導數法(一階、二階、三階)，比較簡單;對稱零面積法可準確識別弱峰;協(xié)方差法較為復雜。而這些高級的尋峰方法主要用于光譜分析中識別弱峰、重峰、假峰等。

本設計采用常見的一階導數法來進行自動尋峰，該方法非常簡單且比較準確，很容易在嵌入式處理器中用軟件實現。

自動尋峰算法流程如下：

①取得300點尋峰范圍內的各索引值的電壓值V。

②分別求得(300—1)個相鄰數值之間的差值d。

③在(WIDTH/2，END—START—WIDTH/2)范圍內開始尋峰。

④取得極大值后，其索引值為i。分別求得左有索引值LEFT和RIGHT。

⑤通過左右索引值及各對應的電壓值擬合一條直線，并求出 i+1處對應的峰高。

⑥若該峰高大于閾值THRESHOLD，且峰的個數≤2，則將該峰高存入數組中，并將索引值i加上WIDTH/2。

⑦尋峰完畢或者出現峰的個數大于2，則退出尋峰。

⑧尋峰結束后，如果峰的個數為2個，則通過計算峰高的比值即C/T，將該比值代入公式中即可求出待測物質的濃度值。

導數法示意圖如圖7所示。

2 系統(tǒng)測試結果

試紙卡在步進電機的驅動下做直線運動，通過光學檢測系統(tǒng)對其進行逐步掃描和信號采集，采集到的信號值通過上位機軟件顯示，采樣到的信號值在T線和C線處形成兩個波峰，克倫特羅的濃度與T線信號成負相關，而C線上捕獲的熒光素標記兔抗信號值則相對固定，C線峰值用作參照，通過尋找T線和C線處的峰值，再通過T線和C線峰值的比值來計算克倫特羅的濃度。

現以測試的一組克倫特羅濃度值為例，采樣到的信號值上位機顯示波形圖如圖8所示。檢測時間總共耗時6 s，其中橫坐標為采樣的點數，總共采樣1 500個點，1 ms采樣一個點，縱坐標為每點所對應的采樣電壓值，兩個波峰分別為T線和C線處的波峰，T線所對應的峰高與被測樣品濃度成負相關，C線所對應的峰高是用作參照的，用來消除背景干擾。

根據尋峰算法可得T線峰高為0.564 V，C線峰高為0.258 V，比值為2.186，代入

。其中y為濃度值，x為比值，得出克倫特羅濃度為0.137 ppb。檢測量程為0.0～0.3 ppb，檢測靈敏度為0.01 ppb。

結語

本文介紹了一種以激光技術、熒光免疫層析技術和激光誘導熒光技術為基礎的定量瘦肉精檢測系統(tǒng)。該系統(tǒng)實現了瘦肉精的快速定量檢測，檢測靈敏度達到了0.01 ppb，同時檢測時間短，能夠大批量檢測，是一個實用且完整的系統(tǒng)，對瘦肉精的精確檢測具有很大的參考意義。